DNA fingerprinting

SCOPO: il DNA fingerprinting è un metodo di indagine che permette di identificare il DNA proveniente da individui diversi. La tecnica è basata sull’analisi di particolari frammenti di lunghezza nota o di sequenze ripetute. In questo esperimento l'obbiettivo era quello di identificare il colpevole tra tre diversi sospettati.

CONTENUTI TEORICI

ENZIMA DI RESTRIZIONE: proteina di origine batterica che permette la rottura del DNA in presenza di particolari sequenze di basi azotate chiamate sequenze palindromiche.

ELETTROFORESI: metodo di analisi che permette di separare parti di DNA in base alla loro massa e di conseguenza di individuare due DNA appartenenti alla stessa persona. Questa procedura prevede l'inserimento dei campioni di DNA all'interno delle cellette presenti nel gel di agarosio , questo particolare ambiente favorisce il rilascio di H+ da parte del DNA rendendolo così negativo, successivamente la scatola elettroforetica voiene attaccata agli elettrodi che generano una differenza di potenziale.

le cellette inoltre sono collocate in prossimità del polo negativo, in quanto il DNA essendo un acido (acido desossiribonucleico) viene attratto dal polo positivo.

GEL DI AGAROSIO: per creare il gel di agarosio si utilizzano lo zucchero (agarosio) e l' acqua, la quantità di zucchero inserita influenza la densità del gel prodotto che può essere quindi utilizzato in situazioni differenti. Dopo aver creato la soluzione essa viene portata ad ebollizione in modo da rompere i legami dello zucchero, durante il successivo raffreddamento che avviene nella cella elettroforetica la soluzione prende la forma del contenitore e forma dei legami molto più reticolati che danno al gel la sua particolare caratteristica.

MATERIALI E STRUMENTI

MICROPIPETTE: strumenti Che permettono di prelevare la corretta quantità di sostanza, durante l'esperimento ne sono state utilizzate tre tipi diversi (1-10microL, 10-100microL, 100-1000microL)

CELLA ELETTROFORETICA

CENTRIFUGA: macchina utilizzata per miscelare le sostanze all'interno delle provette

CELLA RISCALDANTE

4 CAMPIONI DI DNA BATTERICO: il DNA era di batteri procarioti di estericchiacoli, il DNA dei batteri era prelevato dai plasmidi, presenti all'interno del cromosoma in quanto i batteri non presentano il nucleo.

PROCEDIMENTO

Ad ogni campione di DNA è stato aggiunto 17µL di enzima di restrizione il quale attraverso la digestione enzimatica ha diviso il DNA in segmenti di diversa lunghezza. L'enzima e il DNA sono stati inseriti nella centrifuga per unirli. Per far si che la digestione avvenisse, si è dovuto inoltre inserire la provetta all'interno di una cella riscaldata (37 C°), ed unire all'enzima una piccola quantità di magnesio, sostanza che attivava la digestione enzimatica.

Successivamente si è ripetuta la procedura con la centrifuga aggiungendo ad ogni provetta del colorante.

il DNA tramite le pipette è stato trasferito nelle celle elettroforetiche, ed è stata attivata la corrente

dopo trenta minuti....

Grazie ai frammenti di DNA ,visibili con la luce UV e col green gel glass aggiunto precedentemente al gel di agorosio, si è potuto osservare che il colpevole era il sospettato numero tre, in quanto corrispondevano con quelli del campione del colpevole. Durante l' attesa infatti la differenza di potenziale, che genera un campo elettrico, ha permesso ai segmenti di DNA di migrare dal polo negativo a quello positivo differenziandosi in base alla loro massa. Risultano inoltre visibili dalla foto, due segmenti colorati (il superiore blu , l' inferiore viola) , infatti il colorante: loading dye aggiunto era composto tre sostanze bromefanolo xilecianolo e glicerolo (addensante) . La prima sostananza si fermava sulla prima banda in quanto il colorante presentava massa maggiore rispetto alla banda inferiore di xilecianolo. Quando l'abbiamo banda vilola è in prossimità del polo positivo,il processo viene fermato se no i campioni di DNA sarebbero usciti dal gel andando perduti.

creato da Riccardo Brancalion e Martina Saorin

green gel glass

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